实验发现，使用Gibco CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠可以使初始和早期记忆T细胞几乎100%恢复。这种同时进行T细胞分离和活化的一步法能够产生纯净且被均匀活化的T细胞。用CTS Dynabeads CD3/CD28扩增的CD4+和CD8+ T细胞在第10天维持早期记忆表型并且具有克隆多样性。早期去除磁珠是可行的并且提高γ-逆转录病毒的转导效率。CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠可提供可靠的结果，已用于80多种临床试验和商业T细胞药物生产中。

实验方法:

1. 使用CTS Dynabeads CD3/CD28(磁珠:细胞比例为3:1)在细胞培养袋中分离并激活来自健康供体的PBMC的T细胞，其中CTS OpTmizer T细胞扩增SFM补充有CTS免疫细胞血清替代物，Gibco™ L-谷氨酰胺和Gibco™庆大霉素(不完全培养基)。
2. 在移除磁珠后，在细胞培养板或者细胞培养袋中扩增T细胞。
3. 将分离的和活化的T细胞在完全培养基(不完全培养基加100U/mL IL-2)中扩增7–10天；在刺激后第2，3或5天磁性移除CTS Dynabeads CD3/CD28。
4. 用涂有重组人纤维蛋白试剂的微孔板中的编码EGFP的γ-逆转录病毒转导T细胞。
5. 使用流式细胞分析软件在细胞分析仪上进行T细胞的流式细胞术分析。
6. 使用Invitrogen™ Dynabeads™ mRNA DIRECT™纯化试剂盒分离来自T细胞的RNA，并使用Ion AmpliSeq™试剂盒通过TCRβ测序对其进行分析。

实验结果

CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠不需要上游T细胞选择，因为该技术基于CD3和CD28共表达同时分离和激活初始和早期记忆T细胞。流式细胞术分析显示CD3+ CD28+ T细胞被分离，恢复率高(>90%)(图2)。在激活后第3天，细胞被均匀刺激(>95% CD25+)并具有高纯度(>95% CD3+)(图3)。

（CTS Dynabeads CD3/CD28优先分离CD3+ CD28+ 细胞。将PBMC与CTS Dynabeads CD3/CD28以3:1磁珠:细胞的比例孵育30分钟，并分析阴性(非分离)级分并用于计算分离效率。A代表性细胞图，证明CD3+ CD28+ T细胞分离的效率。B恢复实验总结(n = 9)。）

（用CTS Dynabeads CD3/CD28分离的T细胞被均匀刺激且具有高纯度。(A，B)在分析活化标记物之前，将分离的T细胞扩增3天。(C，D)在第0天(起始材料)和激活后第3天和第10天分析T细胞纯度。）

（T细胞扩增后克隆多样性增加。用CTS Dynabeads CD3/CD28分离并活化T细胞。(A)在第0，3和10天，收获样品用于TCRβ测序。(B)在一个实验中，在激活后第3天也用γ-逆转录病毒转导T细胞。）

实验结论

• CTS Dynabeads CD3/CD28分离CD3+ CD28+ T细胞，效率高，纯度高。
• 分离和活化的CD4+和CD8+ T细胞在10天内扩增100至800倍，同时保留年轻表型(CD45RA+/- CD127+/- CD62L+ PD-1-)。
• 基于TCRβ测序，扩增的T细胞具有增加的克隆多样性。
• 第2天去除磁珠提高了γ-逆转录病毒的转导效率。

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品牌                            货号                                     名称

Gibco™                    40203D              CTS™ (Cell Therapy Systems) Dynabeads™ CD3/CD28

Gibco™                    11161D                Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation

BioGems                 05121-25             Anti-Human CD3 SAFIRE Purified