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For All You Seq…-DNA Protein Interactions

导读

由干细胞搜丨干细胞搜网编辑: DNA文库构建:

DNA Protein Interactions

1.DamID

DNA腺嘌呤甲基转移酶相互作用检测

 

DamID允许在活细胞中鉴定蛋白质结合位点而无需交联或免疫沉淀。它在2006年作为微阵列方法开发,然后才适应NGS (Vogel等,2006)。

DamID涉及由DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)和感兴趣的染色质蛋白组成的融合蛋白的低水平表达。该融合蛋白靶向染色质蛋白的天然结合位点,其中Dam甲基化周围DNA中的腺嘌呤。随后,分离甲基化的DNA片段,通过选择性PCR扩增,并测序。

好处:

允许在活细胞中鉴定蛋白质结合位点,而无需交联或免疫沉淀

提供专用算法 (Li et al。,2015)

缺点:

大坝可能有毒

模仿千字节大小的地区

 

2.DNase I SIM

DNase I简化植物的核 – 核方法

 

该方法是专门用于植物的简化DNase I方案(Cumbie等,2015)。它包含在DNase I消化之前在Percoll梯度中进行细胞核纯化的额外步骤,以更有效地去除细胞碎片和淀粉颗粒。使用T4 DNA聚合酶的DNA末端抛光步骤在DNA酶I消化后直接在细胞核中进行。这些额外的步骤消除了对凝胶纯化及其伴随的材料损失的需要。

好处:

不需要凝胶纯化

缺点:

仅针对植物进行了优化

 

  1. MNase-SEQ /

微球菌核酸酶测序/微球菌核酸酶_辅助分离核小体/分离的核小体测序/分离的核小体测序

 

微球菌核酸酶(MNase)来源于金黄色葡萄球菌,其首次用于确定染色质结构的历史可以追溯到1975年,当时该方法被称为各种核葡萄球菌核酸酶或微球菌核酸酶消化细胞核或染色质 (Sollner-Webb et al。, 1975) (Axel等,1975)。随着NGS的出现,MNase消化 (Schones等人,2008) 变得更加流行,并且最终创造了术语MNase-Seq (Kuan等人,2009)。术语MNase辅助分离核小体测序(MAINE-seq) (Cusick等,1981) (Ponts等,2010),Nucleo-Seq (Valouev等,2011)和Nuc-seq (Chodavarapu等,2010) 不常用。与目的蛋白融合的MNase也已用于钙依赖性切割以研究体内特定的基因组基因座(ChEC-seq) (Zentner等,2015)。

在MNase-Seq中,用MNase处理gDNA。保护染色质蛋白结合的序列免受MNase消化。接下来,提取来自DNA-蛋白质复合物的DNA并用于制备测序文库。深度测序可准确表示基因组中调节DNA结合蛋白的位置 (Schones等,2008)

好处:

可以绘制核小体和其他DNA结合蛋白 (Zentner等,2012)

足迹亚核小体颗粒可保护低至约25 bp (Henikoff等,2011)

识别基因组中各种调节蛋白的位置

涵盖广泛的监管网站

缺点:

MNase位点可能不占整个基因组

AT依赖性序列偏倚 (Kensche等,2016)

MNase与ChIP数据的整合对于鉴定和区分相似的蛋白质结合位点是必要的

 

4.X-ChIP

高分辨率交联染色质免疫沉淀测序

 

交联染色质免疫沉淀(X-ChIP)是染色质研究的基础技术 (Breiling等,2001) (Negre等,2001)。随着NGS的出现,这种简单的技术,现在称为X-ChIP-seq,能够产生高分辨率的结果(Skene等,2015)。

该方法包括在室温下用含1%甲醛的细胞中染色质结合的DNA交联10分钟。洗涤细胞并重悬于裂解缓冲液中。在MNase消化后,通过短暂超声处理使染色质溶解,然后进行染色质免疫沉淀。提取DNA,富集短片段,并用于制备测序文库。

好处:

单基分辨率

缺点:

超声处理可能引入序列偏差 (Teytelman et al。,2009)

无论持续时间如何,都能捕获蛋白质-DNA相互作用 (Zentner等,2015)

 

5.ORGANIC

从亲和纯化的天然分离的染色质占据基因组的区域

 

有机物是一种温和的方案,可避免交联和超声处理 (Kasinathan等,2014)。该方法是MNase-Seq和天然ChIP的组合,其提供复杂真核基因组中染色质占据区域的精确图谱。

好处:

避免超声偏差 (Teytelman et al。,2009)

避免交联伪影 (Zentner等,2014)

缺点:

蛋白质的溶解性可能很差 (Zentner et al。,2014)

MNase序列偏倚 (Kensche等,2016)

细胞核隔离可能会引入伪影

其他实验室没有复制

 

6.CATCH-IT

共享附件标签以捕获组蛋白并识别营业额

、CATCH-IT是一种测量全基因组核小体转换动力学的直接方法 (Deal et al。,2010)。在该方法中,用甲硫氨酸替代物叠氮高丙氨酸(Aha)简单处理细胞,其将生物素与含有新掺入的组蛋白的核小体偶联。标记的染色质用链霉抗生物素蛋白进行亲和纯化,严格洗涤以除去非组蛋白,并使用平铺微阵列进行分析。

好处:

可以确定整个基因组中核小体转换的差异

缺点:

潜在的人工制品

 

7.ChIP-Seq/HT-ChIP/ChIP-exo/Mint-ChIP

染色质免疫沉淀测序/高通量ChIP /核酸外切酶修剪ChIP /多重ChIP

 

ChIP-Seq是一种成熟的方法来绘制特定的蛋白质结合位点 (Solomon等,1988)。它产生了大量的衍生物,如AHT-ChIP-Seq (Aldridge等,2013),BisChIP-Seq (Statham等,2012),CAST-ChIP(Schauer等,2013)。,芯片BMS (Li等人。,2011),芯片BS-SEQ (Brinkman等人,2012),ChIPmentation (的Schmidl等人,2015) ,删除片 (Rotem公司等人,2015) ,薄荷-ChIP (van Galen等,2016),PAT_ChIP (Fanelli等,2011),reChIP-seq (Truax等,2012),scChIP-seq(Rotem等,2015)和X-ChIP (Skene等,2014)。顺序ChIP-seq(reChIP)也可以显示染色质上不同蛋白质的关联 (Elsasser等,2015)。在该方法中,DNA-蛋白质复合物在体内交联。接下来,将样品片段化并用外切核酸酶处理以修剪未结合的寡核苷酸。蛋白质特异性抗体用于免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。提取,纯化和测序DNA,得到蛋白质结合位点的高分辨率序列。

好处:

蛋白质结合位点的碱基对分辨率

可以绘制特定的调节因子或蛋白质

外切核酸酶的使用消除了未结合DNA的污染 (Zentner等,2012)

缺点:

非特异性抗体可稀释感兴趣的DNA-蛋白质复合物库

目标蛋白必须是已知的并且能够产生抗体

 

8.HITS-FLIP

采用荧光配体相互作用分析的高通量测序

 

HiTS-FLIP是一种在前所未有的深度测量定量蛋白质-DNA结合亲和力的技术。在该方法中,内置于高通量测序仪中的光学器件用于可视化蛋白质与流动细胞中测序的DNA的体外结合 (Nutiu等人,2011)。

通过合成对具有锚定的单链DNA的微流体流动细胞进行测序。剥离第二链DNA并使用Klenow聚合酶和未修饰的dNTP重建以形成双链DNA簇。以不同浓度引入荧光标记的结合蛋白,并对结合进行成像。

好处:

量化和全面

缺点:

需要专门的硬件

尚未被科学界广泛采用

 

9.Chem-seq

识别被小化学分子束缚的位点

 

Chem-seq可用于检测小分子配体(如治疗药物)与基因组相关蛋白的结合。该信息可以提供关于小分子药物对细胞功能的扰动的重要见解 (Anders等,2014)。

Chem-seq方法使用2种方法。在活细胞中,添加生物素化的药物以允许药物 – 靶标结合。将复合物与甲醛交联,将细胞裂解并超声处理,并将复合物捕获在链霉抗生物素蛋白珠上。将富集的DNA片段纯化并测序。对于体外分析,将生物素化的药物加入细胞提取物中,并按照体内方法进行剩余的步骤。

好处:

可应用于生命,人体细胞

缺点:

创建生物素衍生物可能会改变药物活性

 

10.FAIRE-seq/Sono-Seq

甲醛辅助分离调节元件/交联染色质的超声处理

 

FAIRE-seq (Giresi等,2009) (Hogan等,2006) 和Sono-Seq (Auerbach等,2009) 基于DNA和核小体或序列特异性DNA结合蛋白之间交联效率的差异。 。在该方法中,使用甲醛在体内简单地交联DNA-蛋白质复合物。然后将样品裂解并超声处理。苯酚/氯仿提取后,纯化水相中的DNA并测序。测序提供了未被组蛋白占据的DNA区域的信息。

好处:

简单且高度可重复的协议

不需要抗体

不需要酶,如DNase或MNase,避免酶处理所需的优化和额外步骤

不需要单细胞悬液或核分离,因此很容易适用于组织样本 (Simon et al。,2012)

缺点:

无法识别与DNA结合的调节蛋白

DNase-Seq可能更好地鉴定高表达基因的核小体缺失启动子 (Song et al。,2011)

 

  1. ATAC-SEQ

转座酶 – 可及的染色质测序/ ATAC-seq的测定针对血细胞进行了优化

 

ATAC-Seq使用Tn5转座体检测基因组的无核小体区域 (Buenrostro等,2013)。该方法是常用的,并且优化的方案可用于组织,例如血液(Fast-ATAC) (Corces等人,2016),神经元 (Milani等人,2016),生物样本标本 (Scharer等人,2016)。 )和单细胞(scATAC-seq (Buenrostro等,2015)和单细胞ATAC-seq (Cusanovich等,2015))。

在该方法中,将gDNA与Tn5转座体一起温育,其在开放的染色质区域中将其片段化并同时添加衔接子。纯化区域的深度测序提供了基因组中无核小体区域的碱基对分辨率。

好处:

两步方案,无适配子连接步骤,凝胶纯化或交联反转

与FAIRE-Seq相比,信噪比高

缺点:

在机械样品处理过程中,结合的染色质区域可能会打开并被转座组标记

只有一半的分子含有PCR扩增所需方向的衔接子

适配子位点之间的距离可能不是PCR扩增的最佳选择 (Sos et al。,2016)

 

12.CHIA-PET

配对末端标签测序的染色质相互作用分析

 

ChIA-PET具有免疫沉淀步骤以绘制长程DNA相互作用,类似于Hi-C (Li等人,2010) (Fullwood等人,2009)。在该方法中,DNA-蛋白质复合物被交联和片段化。特异性抗体用于免疫沉淀目的蛋白质。将具有独特条形码的两组接头以分开的等分试样连接到DNA片段的末端,然后基于接近度自连接。沉淀DNA等分试样,用限制酶消化,并测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。Hi-C和ChIA-PET目前在人类基因组中提供最佳的分辨率平衡和合理的覆盖率,以绘制远距离相互作用(Dekker等,2013)。

Tang等人(Tang等人,2015)发表了一种改进的方案,称为高级或长读取ChIA-PET 。该方法用2个半接头和单个生物素化的接头连接取代2个单独的连接反应。接下来,将去交联的纯化的DNA片段化,并使用Tn5转座酶在一个步骤中连接衔接子。最后,对DNA进行PCR扩增和测序 (Sati et al。,2016)

好处:

适用于全球检测大量长程和短程染色质相互作用 (Sajan等,2012)

研究特定蛋白质或蛋白质复合物的相互作用

公共ChIA-PET数据集可通过ENCODE项目获得 (Consortium等,2011)

去除传统ChIP分析过程中产生的背景

免疫沉淀步骤降低了数据复杂性

缺点:

需要大量原料,通常至少1亿个细胞 (Mumbach等,2016)

非特异性抗体可以降低不需要的蛋白质复合物并污染池

连接子可以自我连接,产生关于真正DNA相互作用的模糊性

灵敏度有限; 可以检测到少至10%的相互作用

 

13.3-C

染色质构象捕获测序

 

3C-Seq (Duan等人,2012),Capture-C和Hi-C (Lieberman-Aiden等人,2009) 包括用于分析染色质相互作用的一系列方法。Capture-C使用磁珠将生物素化片段的额外下拉添加到3C方法中。可以使用Capture-C方法(NG Capture-C)的新改进 (Davies等,2016)。Hi-C方法将3C-Seq扩展到全基因组染色质接触图,并且它也已应用于原位染色质相互作用的研究(Sati等,2016) (Rao等,2014)。

在该方法中,DNA-蛋白质复合物与甲醛交联。将样品片段化,并用限制酶提取,连接和消化DNA。对得到的DNA片段进行PCR扩增和测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。

好处:

允许检测远距离DNA相互作用

高通量方法

缺点:

检测可能是由随机染色体碰撞引起的

不到1%的DNA片段实际上产生了连接产物 (Bourgo等,2016)

由于多个步骤,该方法需要大量的起始材料

 

14.4C-seq

圆形染色质构象捕获

 

4C (Zhao等人,2006),(Simonis等人,2006),也称为4C-seq,是类似于3C的方法,有时称为圆形3C。它允许无偏见地检测与特定感兴趣区域相互作用的所有基因组区域(Sajan等,2012)。在该方法中,使用甲醛交联DNA-蛋白质复合物。将样品破碎,连接并消化DNA。得到的DNA片段自我环化,然后进行反向PCR和测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。

好处:

评估各个基因组位点的DNA接触谱的优选策略

高度可重复的数据

缺点:

将错过感兴趣区域的本地交互(<50 kb)

大圆圈不能有效放大

 

15.5C

染色质构象捕获碳复制

 

5C (Dostie等人,2007) 允许同时确定多个序列之间的相互作用,并且是3C的高通量版本 (Sajan等人,2012)。在该方法中,使用甲醛交联DNA-蛋白质复合物。将样品片段化并连接DNA并用限制酶消化。使用连接介导的PCR扩增得到的DNA片段并测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。

好处:

与4C不同,5C为许多对站点提供了交互频率矩阵 (de Wit et al。,2012)

可用于重建较大基因组区域的(平均)3D构象

缺点:

需要监管站点的先验信息 (Sati et al。,2016)

检测可能不一定意味着由随机染色体碰撞引起的相互作用

无法扩展到需要大量引物的全基因组研究

 

 

 

16.PB_seq

蛋白质/ DNA结合后跟随高通量测序

 

PB_seq是一种DNA结合分析,可以在没有染色质的情况下在全基因组范围内表征DNA蛋白结合能量景观 (Guertin等,2012)。它属于通常通过指数富集(SELEX)系统进化配体的方法家族 (Ozer等,2014)。对基因组DNA进行超声处理,大小选择和纯化。在与DNA结合蛋白杂交后,分离,提取蛋白质结合的DNA并制备用于测序。

好处:

确定与染色质结构无关的结合效率

缺点:

尚未被科学界广泛采用

 

17.Pu-seq

聚合酶使用测序

 

Pu-seq提供直接的复制起源位置和效率数据,以及复制时间的间接估计 (Daigaku等,2015)。

含有双链核糖核苷酸的DNA的碱处理导致磷酸骨架对核糖的裂解3’,产生5’羟基末端。如果变性DNA用作随机六聚体引物延伸的模板,则5ê至3ê合成导致邻近初始核糖的齐平末端。通过从单链DNA产生文库并在每个末端放置不同的索引引物,可以将测序读数定位到单个链,以确定具有单碱基准确度的原始核糖核苷酸位置。

好处:

单基准确度

缺点:

仅适用于酵母

 

18.SELEX or SELEX-seq / HT-SELEX

通过指数富集的指数富集/高通量配体系统演化的配体的系统演化

 

自1990年3个独立小组描述第一次SELEX实验时 (Ellington等,1990) (Tuerk等,1990)(Sullenger等,1990),该方法适用于广泛的范围技术 (Chen et al。,2016) (Takahashi et al。,2016)。为NGS开发了一种高度多路复用的并行HT-SELEX方法 (Jolma等,2010)。SELEX-seq的变体 (Slattery等,2011) 使用Nextera衔接子序列进行有效的文库制备 (Zhang等,2016)。

在该方法中,蛋白质表达为与pD40htSELEX表达载体中与高斯荧光素酶缀合的链霉抗生物素蛋白结合肽(SBP)的融合体。每个DNA配体含有14bp随机区域(14N)和5bp条形码,其唯一地识别单个SELEX样品。部分嵌套的引物用于连续的SELEX轮次。将含有所有可能的14bp序列的双链DNA混合物与固定在96孔板的孔中的DNA结合蛋白一起温育,导致DNA与蛋白质结合。洗涤和洗脱后,通过PCR扩增得到的更具特异性序列的群体并测序 (Caroli等,2016)

好处:

高通量和高效率

软件管道可用 (Hoinka等,2016)(Caroli等,2016)

缺点:

可能包含序列偏差

 

19.HITS-FLIP

采用荧光配体相互作用分析的高通量测序

 

HiTS-FLIP是一种在前所未有的深度测量定量蛋白质-DNA结合亲和力的技术。在该方法中,内置于高通量测序仪中的光学器件用于可视化蛋白质与流动细胞中测序的DNA的体外结合 (Nutiu等人,2011)。

通过合成对具有锚定的单链DNA的微流体流动细胞进行测序。剥离第二链DNA并使用Klenow聚合酶和未修饰的dNTP重建以形成双链DNA簇。以不同浓度引入荧光标记的结合蛋白,并对结合进行成像。

好处:

量化和全面

缺点:

需要专门的硬件

尚未被科学界广泛采用

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