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关于外泌体培养的那些事

什么是外泌体

简单介绍⼀下细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)。细胞外囊泡是细胞以多种形式分泌到细胞外的各种囊泡:

其主要分为外泌体(Exosomes)直径为30-150nm,以内吞的形式释放到细胞外;微囊泡(Microvesicles)直径为100-1000nm,以出芽的形式释放到细胞外;凋亡⼩体(Apoptotic body)直径为50-2000nm,由凋亡细胞产⽣。

生理功能:

外泌体是细胞与细胞间通讯中起关键作⽤的胞外基质成分,⼴泛参与细胞间物质运输与信息传递,调控细胞⽣理活动;同时,外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫调节作⽤和诱导正常细胞转化,促进肿瘤发⽣及转移的作⽤;此外,外泌体还可以作为“天然的纳⽶粒⼦”来进⾏药物递送,装载的药物类型包括⼩分⼦化学药物、蛋⽩质和肽、核酸药物等。

样本来源:

目前外泌体研究的样本主要是以细胞培养上清以及各种体液为主,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

分离手段:

外泌体分离的方式方法有很多很多种,这边就比较其相对的优劣势进行简单的比较:

1.差速超速离⼼:差速超速离⼼是⼤家最熟悉的⼀种分离⽅法,⽂献中⽤得最多的且也是⽬前⽐较能受到认可的⽅法。差速超速离⼼是先通过低速离⼼去除细胞和细胞凋亡碎⽚,再通过超⾼速去除⼤囊泡和沉淀外泌体。此⽅法分离得到的外泌体可⽤于后续的鉴定实验、分⼦检测实验、细胞实验和动物实验。

2.密度梯度离⼼:此⽅法多指蔗糖密度梯度超速离⼼。此⽅法从不同密度的颗粒中分离出囊泡,对离⼼的时间⽐较敏感。如果外泌体和颗粒密度相似,外泌体可能会被其他颗粒污染。

3.超滤:超滤过程中需要⽤超滤膜进⾏外泌体隔离。在分离过程中,外泌体可能会阻塞过滤孔,导致膜的寿命减短,分离效率较低。同时,外泌体会粘附在膜上,导致产量降低。

4.免疫磁珠法:⽤包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合,即可将外泌体吸附并分离出来。该⽅法分离得到的外泌体的⽣物活性易受pH和盐浓度影响,不利于下游实验。

5.试剂盒分离法:⽬前商业化的外泌体提取试剂盒多种多样,提取效果良莠不齐。同时试剂盒本⾝的价格⽐较⾼,且外泌体的得率和纯度⼀般,不是性价⽐⾼的⼀种分离⽅法。

外泌体的鉴定:

外泌体分离之后,需要经过⼀系列鉴定才能确定分离的是外泌体。。下⾯介绍⼏种鉴定⽅法:

1.透射电镜鉴定法:透射电镜,全称为透射电⼦显微镜(Transmission Electron Microscope,简称TEM),分辨率为0.1~0.2nm,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,⽤于鉴定样本中是否存在外泌体样结构,即通常为茶托型或⼀侧凹陷的半球形。

2.浓度粒径检测法:纳⽶颗粒跟踪分析法,简称NTA(Nanoparticle Tracking Analysis),该技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征⼿段之⼀。NTA技术的样本处理简单、能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

3.Western Blot分⼦标志物检测: WB可以⽤来鉴定外泌体的标志蛋⽩是否存在于样本中。外泌体标志蛋⽩包括四跨膜蛋⽩家族,如CD9、CD63和CD81;细胞质蛋⽩,如肌动蛋⽩(Actin)和钙磷脂结合蛋⽩(Annexins);参与⽣物功能的分⼦,如凋亡转接基因2互作蛋⽩X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋⽩(TSG101)、热休克蛋⽩(HSP70、HSP90),以及细胞分泌的特异性蛋⽩。

4.流式细胞术检测:外泌体可以先进⾏荧光标记,再通过流式细胞仪检测外泌体表⾯标记蛋⽩。但是传统的流式细胞仪检测样本的颗粒⼤⼩是300-500nm,⽽外泌体直接都在300nm以下,因此,可能⼤量的外泌体检测不到,造成分析不太准确。

5.ELISA检测:根据外泌体的表⾯标志物,如CD9、CD63进⾏ELISA实验,来检测外泌体的蛋⽩量,从⽽实现对外泌体的分析。但是ELISA⽅法容易受其他抗原的⼲扰,引起实验结果出现偏差。

外泌体提取下游实验:

1.外泌体microRNA测序/芯⽚:通过对外泌体microRNA的⾼通量分析,可以找到不同外泌体之间差异表达的microRNA,为后续的功能学实验做准备。

2.外泌体mRNA测序/芯⽚:通过对外泌体转录组测序或表达谱芯⽚分析,可以找出不同外泌体之间差异表达的mRNA,从⽽发现外泌体中哪些基因发⽣了变化。

3.外泌体lncRNA芯⽚:通过lncRNA芯⽚可以同时得到lncRNA和mRNA数据,为研究者提供更完整的lncRNA和mRNA筛查。

4.外泌体ceRNA芯⽚:竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)机制如下:microRNA(miRNA)处在调控⽹络的中⼼,lncRNA分⼦富含miRNA结合位点,可以竞争性地结合miRNA,解除miRNA对其靶基因的抑制作⽤,进⽽调控基因的表达⽔平。通过ceRNA芯⽚可以为研究者提供完整的lncRNA,circRNA和mRNA筛查。

5.外泌体蛋⽩质组学:主要包括iTRAQ蛋⽩质组定量/TMT标记定量蛋⽩质组学/label free蛋⽩质组定量。通过蛋⽩质组学分析,寻找差异表达蛋⽩,并揭⽰其细胞⽣理病理功能。