产品名称：HY STEMCELL E8725F人间充质干细胞无血清培养基（完全培养基）

英文名称：CCGmHuM® E8 Cocktail human MSCs Serum-Free Medium

产品货号：E8725F

产品品牌：HY STEMCELL

一、 产品组份及概述
产品组份：

A. CCGmHuM® E8 Cocktail human MSCs Serum-Free Medium 基础培养基 450mL  4℃冷冻保存，产品批次和效期见：标签 或 瓶身喷码。

B.CCGmHuM®  Human MSCs Supplement Medium（10x）细胞因子添加物50mL  -20℃冰冻保存。（反复冻融5次内不影响产品质量）

货号：E8725F                    成品 包装规格为：450+50mL/瓶

本产品包括以下8种明确公开组份：

DMEM/F12 base        Essential GFs

Glutamine             Transferrin

NaHCO3               Albumin

Selenium              Insulin

其中Essential GFs为十余种蛋白生长因子，是人间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSCs）生长所必需的，以Cocktail形式融入E8725F无血清培养基中。

二、技术指标
1.物理性状：添加剂呈淡黄色，澄清透明，PH7.0~7.6。

2.细菌培养：阴性

3.支原体培养：阴性

4.HBV-sAg：阴性

5.HIV-Ab：阴性

6.HCV-Ab：阴性

7.梅毒螺旋体抗体：阴性

8.牛血清白蛋白：阴性

9.热源内毒素：小于1EU/mL

10.细胞生长：细胞为梭形，呈指纹状或螺旋状生长；原代细胞贴壁生长和传代细胞生长良好。

三、 完全培养基的配制
将完全溶解的CCGmHuM® Human MSCs Supplement Medium（10x）细胞因子添加物加入到相应体积的基础培养基中，充分混合均匀，制备成完全培养基。培养基和CCGmHuM® Human MSCs Supplement Medium（10x）细胞因子添加物的混合比例为9:1，即每9mL基础培养基需要添加1mL细胞因子添加物。
为维持添加物中细胞生长因子的活性，请将配制好的完全培养基置于4℃避光保存，储存时间不宜超过4周，1周内用完最佳。

四、各种组织来源MSCs的使用说明及冻存
本产品可用于骨髓、脐带、脐血、胎盘、脂肪等各种组织来源的人间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSCs）的培养，包括原代细胞的培养和传代细胞的扩增。

本产品尤其适于临床级MSCs的培养。经该体系培养的MSCs可用于临床治疗等用途。

4.1、人骨髓间充质干细胞培养
1.将骨髓样品制备成单细胞悬液，推荐使用密度梯度离心法获得单个核细胞进行以下实验。

★ 注意：人骨髓单个核细胞的分离，可采用Ficoll-Hypaque（比重1.077g/mL），或Percoll（比重1.073g/mL）。后者毒性小，且分离细胞纯度较好。

2.PBS清洗细胞两次。

★ 注意：两次离心速度不同。第一次收集的细胞悬液中含有Ficoll-Hypaque或Percoll，应加足量PBS稀释，离心速度不低于密度梯度离心时的速度。第二次离心时，可用常规速度沉降细胞。

3.弃上清，用完全培养基重悬细胞。

4.细胞计数，调整细胞浓度为5～7.5×106/mL。

5.根据拟采用培养瓶或培养皿的底面积，计算接种细胞总量。一般而言，细胞来源不同，接种密度可适当调整， 5～10×105/cm2适于多数情况下人骨髓间充质干细胞的培养。如细胞来源于G-CSF动员的骨髓或经胶原酶消化的骨髓小粒，接种密度可较低；如细胞来源于化疗后骨髓或老年人，细胞接种密度可达1.0×106/cm2。

6.将接种好的细胞置于5% CO2，湿度大于95%的37℃培养箱培养。根据细胞生长状况换液。

★ 注意：一般文献推荐培养48小时后去除非贴壁细胞。然而，骨髓单个核细胞培养48小时后，将贴壁细胞与非贴壁细胞分别培养，两种体系收获的骨髓MSCs数量相近。因此，我们强烈推荐：单个核细胞接种次日观察有无污染；如无污染现象，可持续培养5～7天，或至培养基变黄。之后，去除非贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养。

4.2、人脐带间充质干细胞培养
1.按照常规方法分离人脐带Walton胶中的细胞。

★ 注意：从脐带组织中分离细胞的方法，严重影响最终所得细胞纯度和质量。脐带组织中含有内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、外膜细胞、间充质干细胞乃至单核巨噬细胞等。以上细胞均可贴壁，有些生长速度也较快，且细胞也多呈纺锤形。这些细胞不易与间充质干细胞区分。建议：从脐带剥离Walton胶并剪切成小块的过程中用生理盐水反复漂洗干净 或 使用酶消化法进行间充质干细胞的分离，以保障所得细胞纯度。

2.PBS清洗细胞1次。

3.弃上清，用完全培养基重悬细胞。

4.细胞计数，调整细胞浓度为5×106/mL。

5.根据拟采用培养瓶或培养皿的底面积，计算接种细胞总量。一般而言，细胞来源不同，接种密度可适当调整，5～7.5×105/cm2适于多数情况下人脐带间充质干细胞的培养。

6.将接种好的细胞置于5% CO2和100%相对湿度的37℃培养箱培养。根据细胞生长状况换液。

★ 注意：一般文献推荐培养48小时后去除非贴壁细胞。我们建议：培养次日观察有无污染；如无污染现象，可持续培养5～7天，或至培养基颜色变黄。之后，去除非贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养。

4.3、脂肪间充质干细胞的分离
1. 人脂肪组织来自脂肪抽吸患者的废弃脂肪组织。

2. 无菌PBS反复漂洗除菌。

3. 将脂肪组织转移至50mL或250mL离心管，加入等体积的使用alpha-MEM配制的胶原酶溶液，使其终浓度达到0.1%（重量/体积）。

4. 37℃，摇床（120rpm）消化2小时以上。

5. 室温静置10分钟，吸除上层油滴。

6. 离心，800g，10分钟，收集消化细胞。

7. PBS洗涤一次，500g，10分钟。MSCs无血清完全培养基悬浮细胞。

8. 计细胞数，调整细胞浓度，按照5～10×105/cm2底面积接种。

9. 次日观察，如无污染，继续培养至培养基颜色变黄，或贴壁细胞密度达到30%以上。补充新鲜的MSC无血清完全培养基。

10. 细胞密度达到80%左右时，按照以下步骤传代培养。

4.4、间充质干细胞的换液
吸去旧的间充质干细胞的完全培养液，加入足量新鲜的预热至37℃的间充质干细胞完全培养液。

换液时间：当间充质干细胞的完全培养液变酸（培养液的颜色变黄），而且此时细胞尚未达到80%融合，则应该予以换液。一般来说，间质干细胞的换液间隔为3～4天。

4.5、间充质干细胞的传代
间充质干细胞生长至80％融合时，就应该按照下面步骤进行传代。

★注意：为保证间充质干细胞的多向分化能力和增殖能力，强烈建议细胞达80%时即进行传代培养。如细胞密度过大，细胞会出现自发分化现象，表现为细胞大小不一，I型胶原等胞外基质分泌量明显增加，导致使用胰蛋白酶消化时，细胞成片脱落，最终收获的细胞数反而下降。因此，不可让间充质干细胞完全融合或过度融合，这将严重影响细胞的生长状态。建议：48～66小时之间，就要加强观察，避免细胞生长过密。

1. 吸去培养液。

2. 用1×PBS洗涤细胞2次，以去除残留的培养液。

★注意：使用该无血清体系培养的间充质干细胞，其贴壁能力微弱于血清培养细胞。因此，如用培养皿培养，建议沿培养皿的侧壁缓缓加入PBS；如用培养瓶培养，建议沿培养瓶的上壁加入PBS，以免细胞脱落，影响收获细胞数。

3. 加入PBS，之后加入0.25％Trypsin-0.1%EDTA，PBS与胰蛋白酶体积比为4:1，两者总量以覆盖培养皿或培养瓶表面为宜。轻轻旋转，置37℃培养箱中消化3～5分钟。用手轻拍培养器皿的壁，显微镜下可见绝大部分细胞变圆，极少量细胞贴壁仍呈纺锤形，极少量细胞已经悬浮即可终止消化。依据不同批次胰蛋白酶活性不同，消化的时间以显微镜下观察细胞变圆为准，但是，推荐消化时间不低于3分钟。

★注意：对于人间充质干细胞，尤其是利用该体系培养的细胞而言，其消化脱壁的时间应该较短，难以消化脱壁的细胞多数可能不是间充质干细胞，而是其他的杂细胞。在原代培养第一次传代时，尤其注意消化时间；如将所有细胞收获，其中必然含有单核巨噬细胞等杂细胞。

4. 立即加入等体积的间充质干细胞完全培养液，用吸管吸取液体，反复吹打培养器皿底壁，使细胞彻底脱离瓶皿底壁。

★注意：吹打时动作不宜过猛，避免产生气泡。对于一个细胞而言，气泡的张力很大，其破裂足以杀死周围的细胞，导致细胞内基因组DNA释放，细胞呈粘稠的团状物，会严重影响细胞收获的数量和质量。

5. 离心（250g，5分钟），吸去上清液。

6. 用2～3mL间充质干细胞的完全培养液重悬细胞。

7. 按照6000个细胞/cm2的密度来接种细胞。

8. 加足够的间充质干细胞的完全培养液，在37℃，5％ CO2和100%相对湿度的培养箱中培养。

使用CCGmHuM® E8 Cocktail human MSCs Serum-Free Medium人间充质干细胞无血清培养基培养脐带间充质干细胞细胞形态图

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